p53变异在结肠癌原发灶和肝转移灶的配对比较及其与术后生存的关系
作者：杨洋 闻炳基 袁玮
单位：杨洋 闻炳基 袁玮(第一军医大学附属南方医院肿瘤科，广东广州510515)
关键词：大肠肿瘤；p53基因；生存期
癌症000504
【摘要】目的：了解p53基因及其蛋白在大肠癌发生、转移过程中的动态变化以及p53变异与生存期的关系。方法：以Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE)及自动DNA序列分析检测p53基因exon5～9。结果：41例被检病人中26例呈p53变异(63%)，其中6例仅在肝转移灶发现p53变异,其余均为原发灶、转移灶一致性的变异。另有3例原发灶已有p53变异的病人，在转移灶出现了新增加的变异。生存分析显示，在肝转移灶含变异型p53的病人比含野生型p53者具有更长的术后生存期。结论：大肠癌肝转移，p53变异主要开始于肠癌原发灶，并保持于转移至肝脏的癌细胞内，小部分p53变异也可以始发于转移灶。实施肝部分切除术的患者,转移癌灶含变异型p53者的术后生存期比含野生型p53者长。
, http://www.100md.com
中图分类号：R735.34文献标识码：A文章编号：1000-467X(2000)05-0409-03
The composition of p53 status between primary and liver metastatic colorectal cancer, and its relationship with survival after hepatectomy
YANG Yang, WEN Bing-ji, YUAN Wei
(Department of Oncology, Nanfang Hospital, Guangzhou 510515, P.R. China)
【 Abstract】 Objective： To investigate p53 gene status during the processes of the occurrence of colorectal carcinoma and metastasis,and the relationship between p53 mutation and survival. Methods： p53 gene status (exon5～ 9) was examined by PCR, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) and automated sequencing. Results： p53 alterations were found in exons 5 through 9 at 26 of 41 patients (63% ). Among them, 6 patients had mutations only in the liver metastatic lesions but not in their original tumors, while the others were found the same mutation on both of primary colorectal and hepatic metastatic lesions, and an additional mutation in the metastatic lesions was found in three cases. Surviving analysis revealed that, after hepatectomy the patients with p53 mutations had a longer survival than those with wild p53. Conclusion： p53 mutations, for the colorectal carcinomas followed by hepatic metastases, mainly start in the primary colorectal lesion and then is kept and brought into hepatic organ; it also might start from metastatic lesion in a few cases. For the patients who had colorectal cancer liver metastasis and underwent partial hepatectomy, the survival time is longer in mutant p53 group than in wild type p53 group.
, 百拇医药
Key words： Colorectal neoplasms; p53 gene; Survival time
肝内转移是结直肠癌的主要再发形式，临床经验表明，它显著的影响患者5年生存期，因此，具有研究意义。
p53基因的变异或缺失被认为是人类肿瘤中最常见的基因失常[1]。关于p53变异与病人生存期的关系，一直有不同的报道[2,3]。在结直肠癌患者，有报道p53突变可明显缩短其生存期，也有人认为两者没有相关关系。对研究对象的选择不严格可能是一个重要因素，而不同的方法学可能是另一个因素(大多数研究采用的是免疫组化法)。本实验严格筛选了41例结直肠癌继发肝内转移、并接受了肝部分切除术的病人，采用自动DNA序列分析方法对原发灶和转移灶的p53状态进行鉴定，同时分别对转移灶内含野生型和突变型p53的患者进行生存期的分析和比较。
1材料和方法
, http://www.100md.com
1.1肿瘤组织标本
收集大肠癌根治性切除术后5个月～5年内，因肝转移接受肝切除术患者的大肠原发灶及肝转移灶石蜡标本共41例。所有标本的肿瘤细胞含量均>90%，组织定性为大肠腺癌。
1.2DNA提取
按饱和酚/氯仿抽提法[4]。测OD260/OD280,二者比值在1.7～1.8。
1.3PCR
PCR扩增条件为：95℃30s→58℃30s→72℃90s,共35个循环。最后经过72℃7min“延伸”步骤，进入4℃程序下保存。为DGGE分析之故，在每一对引物的正向引物5'端加有一个28-bp长的GC-rich序列。
1.4DGGE
, 百拇医药
DGGE按文献[3，5]方法进行，电泳在56℃，150V条件下，所需时间及变性剂浓度依exon的不同而不同。电泳后，胶板经3μg/ml的溴化乙啶染色20min，在紫外灯透照器上观察并摄像。
1.5DNA序列分析
在DGGE分析中检出p53变异条带的样本需进一步进行DNA序列分析。大约100ng纯化后的PCR片断被作为模板加到20μlDNA序列分析反应液中(PerkinElmer,USA)，反应液含3.2pmole和DGGE时同样的引物。分别经95℃30s，50℃15s，60℃4min25个周期处理后，酒精沉淀产物，沉淀物再被溶解于25μl的TemplateSuppressionreagent(PerkinElmer)内，在ABIPRISMTM310自动基因序列分析仪中测序。每一样本分别进行上下游两个方向的检测。当一个肿瘤标本被发现有一个以上的p53变异，需再重复一次全部反应过程(包括DNA扩增，PCR片断的提纯以及序列分析)，以排除假阳性。
, 百拇医药
1.6统计学处理
生存分析采用Kaplan-Meiersurvivalanalysis程序。
2 结果
2.1p53突变
41例中，26例(63%)在p53exon5～9发现变异。其中18例显示大肠原发灶和肝转移灶为相同的变异；6例显示p53变异仅发生于肝转移组织;另有3例原发灶有p53变异的病人在转移灶除保留原有变异外，还出现了新增加的变异。在原发、转移灶共47处p53变异中，以Codon196,248,273最为多见(图1)。点突变主要表现为G∶C→A∶T,氨基酸的改变主要为精氨酸和谷氨酸。
图1 41例大肠癌肝转移患者原发灶和肝转移灶
, 百拇医药
p53突变在各codon的发生频率
图2肝转移灶含变异及野生型p53患者的生存期分析
2.2生存分析
根据肝转移灶中p53DNA测序结果将病人分为野生型p53组和突变型p53组，分别统计两组病人肝部分切除术后的生存期，以Kaplan-MeierSurvivalAnalysis程序分析(图2)。p53突变组的中位生存期是80个月，而野生型P53组仅为18个月；Log-rankTest发现两组病人生存期有显著性差异(P=0.0068)。在p53突变组未发现任何特异的变异与生存期有规律性的联系，但p53无义突变病例的生存期明显短于p53突变组中的其他病例。
3讨论
, 百拇医药
结直肠癌特别是在有继发肝转移时，p53基因突变率高达50%～80%[2，7]，本组患者突变率为63%，与报道相符。P53突变热点分别在exon8的248和273密码子以及exon6的196密码子，亦与文献报道相符[6,8]。点突变主要表现为G∶C→A∶T,改变后的氨基酸主要为精氨酸和谷氨酸。
本实验基因分析证明，18例在原发灶显示的p53变异，在其相应的转移灶均被证实；另有6例在大肠原发灶未证实到变异p53的病人，在肝转移灶出现了p53变异；3例在原发灶已有p53变异的病人，在转移灶除观察到同样的变异外，还发现了新的变异。由此证明，p53变异主要开始于原发大肠癌灶，并保持于转移到肝脏的大肠癌细胞内，在转移过程中变异了的p53特性不变，只有极少数其变异位点增多。p53突变偶尔也可以始发于转移癌灶。
关于p53突变和患者生存期的关系，相关的文献一直比较多，有作者报道p53突变的结直肠患者生存期明显缩短[2，8]，也有人认为两者间设有相关的关系[9]，但均是直接比较结直肠癌病人的p53status和生存期，从未有作者对结直肠癌肝转移病人的p53status和术后生存期的关系进行研究。本实验表明，在肝转移灶有p53变异的病人，肝切除术后，存活时间长于癌灶内没有p53变异病人，而后者的死亡原因主要为癌复发。如果p53由于细胞周期调控而在抑制肿瘤生长中起到一个关键作用，从基因学的角度，按照逻辑思维，应该有理由观察到如期望那样的p53突变和生存期的负相关关系。而我们的结果却提示在肝手术后这样特定条件下，机体并不遵循上述规律。
, 百拇医药
我们推测这是因为在肝部分切除之后，机体内由Kupffer细胞、肝细胞及其他细胞合成、分泌的生长因子应激性地显著增加(包括EGF、HGF、IGF-I、II、TGF-α、β等)[10]，它们不仅刺激正常肝组织细胞的再生，也作用于残留在肝内的癌细胞。因此，基于治疗意义的外科手术过程，对于那些术中未被发觉而残留于肝内的微小癌细胞灶，在客观上创造了一个加速生长的生物学环境。在同样一个生物学环境下为什么有正常p53基因(野生型p53)的癌细胞远比p53基因突变的癌细胞增生快、出现临床复发早？我们推测这两类细胞代表生物学上不同的细胞群。p53突变基因的积累(我们前期工作证明，p53变异的DNA量或含变异p53的癌细胞量在转移灶明显高于原发灶[11])可能使其肿瘤细胞在生物功能上损害更多，导致含突变型p53的癌细胞比含野生型p53的癌细胞对生长刺激的敏感性降低，因而对于术后大量释放出的生长因子的反应低于后者，使含突变p53的残余癌细胞在术后增生繁殖速度远低于野生型p53的癌细胞。这也就决定了后者的术后复发早于前者、术后生存期短于前者。应指出，这两组病人生存期的差异并不意味着p53基因突变改善了患者术后生存期，很可能是p53无突变使肿瘤患者的术后生存期缩短了。以上假说有待进一步的实验来验证。
, http://www.100md.com
致谢：本研究得到瑞典哥德堡大学医学部外科peterNaredi,Kentlundholm教授的指导和支持，在此致谢!
基金项目：全军医药卫生科研基金(98H013),国家自然科学基金(39970721)及广东省自然科学基金(990411)
[参考文献]
[1] Marx J. how Cells Cycle toward cancer [J]. Science,1994, 263： 319～ 319.
[2] Saigusa N, Maruyama K, Sugimura H, et al. The results of p53 immunostaining in colorectal adenomas, early cancers, advanced cancers and their hepatic metastasis [J]. Gan To Kagaku Ryoho, 1996, Suppl 2： 159～ 163.
, http://www.100md.com
[3] Cottu PH, Muzeau F, Estreicher A, et al. Inverse correlation between RER+ status and p53 mutation in colorectal cancer cell lines [J]. Oncogene, 1996, 13： 2727～ 2730.
[4] M kato, Iot Y, Kobayashi S, et al. Detection of DCC and Ki-ras gene alterations in colorectal carcinoma tissue as prognostic markers for liver metastatic recurrence [J]. Cancer, 1996, 77： 1729～ 1735.
[5] Kropveld A, Slootweg PJ, Mansfeld AD, et al. Radioresistance and p53 status of T2 laryngeal carcinoma： Analysis by immunohistochemistry and denaturing gradient gel electophoresis [J]. Cancer, 1996, 78： 991～ 997.
, http://www.100md.com
[6] Pocard M, Chevillard S, Villaudy J, et al. Different p53 mutations produce distinct effects on the ability of colon carcinoma cells to become blocked at the G1/S boundary after irradiation [J]. Oncogene, 1996, 12： 875～ 882.
[7] Maruyama K, Tanaka T, Baba S, et al. p53 accumulation in colorectal cancer with hepatic metastasis [J]. Japanese J Cancer research, 1996,87(4)： 368～ 376.
[8] Diez M, Camunas J, Enriquez JM, et al. A Comparative study on the prognostic value of the nuclear expression of protein p53 vis-a-vis histopathology in colorectal cancer [J]. An-Med-Interna, 1996, 13： 222～ 226.
, 百拇医药
[9] Miki T,Funahashi K,Tsujita K,et al. An immuno-histochemical study of the relation-ship between p53 expression and the DNA ploidy pattern using image cytometry in colorectal carcinoma [J]. Gan To Kagaku Ryoho, 1995, 22 Suppl 2： 130～ 133
[10] Brenner DA. Signal transduction during liver regeneration [J]. J Gastroenterol Hepatol， 1998,13(5)： 93～ 95
[11] 杨洋，夏琼，连方杰，等.大肠癌患者原发灶和肝转移p53变异及蛋白表达[J].中华肿瘤杂志,1999,21(2)：114～118.
收稿日期：1999-11-01；修回日期：1999-11-19, 百拇医药
单位：杨洋 闻炳基 袁玮(第一军医大学附属南方医院肿瘤科，广东广州510515)
关键词：大肠肿瘤；p53基因；生存期
癌症000504
【摘要】目的：了解p53基因及其蛋白在大肠癌发生、转移过程中的动态变化以及p53变异与生存期的关系。方法：以Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE)及自动DNA序列分析检测p53基因exon5～9。结果：41例被检病人中26例呈p53变异(63%)，其中6例仅在肝转移灶发现p53变异,其余均为原发灶、转移灶一致性的变异。另有3例原发灶已有p53变异的病人，在转移灶出现了新增加的变异。生存分析显示，在肝转移灶含变异型p53的病人比含野生型p53者具有更长的术后生存期。结论：大肠癌肝转移，p53变异主要开始于肠癌原发灶，并保持于转移至肝脏的癌细胞内，小部分p53变异也可以始发于转移灶。实施肝部分切除术的患者,转移癌灶含变异型p53者的术后生存期比含野生型p53者长。
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中图分类号：R735.34文献标识码：A文章编号：1000-467X(2000)05-0409-03
The composition of p53 status between primary and liver metastatic colorectal cancer, and its relationship with survival after hepatectomy
YANG Yang, WEN Bing-ji, YUAN Wei
(Department of Oncology, Nanfang Hospital, Guangzhou 510515, P.R. China)
【 Abstract】 Objective： To investigate p53 gene status during the processes of the occurrence of colorectal carcinoma and metastasis,and the relationship between p53 mutation and survival. Methods： p53 gene status (exon5～ 9) was examined by PCR, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) and automated sequencing. Results： p53 alterations were found in exons 5 through 9 at 26 of 41 patients (63% ). Among them, 6 patients had mutations only in the liver metastatic lesions but not in their original tumors, while the others were found the same mutation on both of primary colorectal and hepatic metastatic lesions, and an additional mutation in the metastatic lesions was found in three cases. Surviving analysis revealed that, after hepatectomy the patients with p53 mutations had a longer survival than those with wild p53. Conclusion： p53 mutations, for the colorectal carcinomas followed by hepatic metastases, mainly start in the primary colorectal lesion and then is kept and brought into hepatic organ; it also might start from metastatic lesion in a few cases. For the patients who had colorectal cancer liver metastasis and underwent partial hepatectomy, the survival time is longer in mutant p53 group than in wild type p53 group.
, 百拇医药
Key words： Colorectal neoplasms; p53 gene; Survival time
肝内转移是结直肠癌的主要再发形式，临床经验表明，它显著的影响患者5年生存期，因此，具有研究意义。
p53基因的变异或缺失被认为是人类肿瘤中最常见的基因失常[1]。关于p53变异与病人生存期的关系，一直有不同的报道[2,3]。在结直肠癌患者，有报道p53突变可明显缩短其生存期，也有人认为两者没有相关关系。对研究对象的选择不严格可能是一个重要因素，而不同的方法学可能是另一个因素(大多数研究采用的是免疫组化法)。本实验严格筛选了41例结直肠癌继发肝内转移、并接受了肝部分切除术的病人，采用自动DNA序列分析方法对原发灶和转移灶的p53状态进行鉴定，同时分别对转移灶内含野生型和突变型p53的患者进行生存期的分析和比较。
1材料和方法
, http://www.100md.com
1.1肿瘤组织标本
收集大肠癌根治性切除术后5个月～5年内，因肝转移接受肝切除术患者的大肠原发灶及肝转移灶石蜡标本共41例。所有标本的肿瘤细胞含量均>90%，组织定性为大肠腺癌。
1.2DNA提取
按饱和酚/氯仿抽提法[4]。测OD260/OD280,二者比值在1.7～1.8。
1.3PCR
PCR扩增条件为：95℃30s→58℃30s→72℃90s,共35个循环。最后经过72℃7min“延伸”步骤，进入4℃程序下保存。为DGGE分析之故，在每一对引物的正向引物5'端加有一个28-bp长的GC-rich序列。
1.4DGGE
, 百拇医药
DGGE按文献[3，5]方法进行，电泳在56℃，150V条件下，所需时间及变性剂浓度依exon的不同而不同。电泳后，胶板经3μg/ml的溴化乙啶染色20min，在紫外灯透照器上观察并摄像。
1.5DNA序列分析
在DGGE分析中检出p53变异条带的样本需进一步进行DNA序列分析。大约100ng纯化后的PCR片断被作为模板加到20μlDNA序列分析反应液中(PerkinElmer,USA)，反应液含3.2pmole和DGGE时同样的引物。分别经95℃30s，50℃15s，60℃4min25个周期处理后，酒精沉淀产物，沉淀物再被溶解于25μl的TemplateSuppressionreagent(PerkinElmer)内，在ABIPRISMTM310自动基因序列分析仪中测序。每一样本分别进行上下游两个方向的检测。当一个肿瘤标本被发现有一个以上的p53变异，需再重复一次全部反应过程(包括DNA扩增，PCR片断的提纯以及序列分析)，以排除假阳性。
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1.6统计学处理
生存分析采用Kaplan-Meiersurvivalanalysis程序。
2 结果
2.1p53突变
41例中，26例(63%)在p53exon5～9发现变异。其中18例显示大肠原发灶和肝转移灶为相同的变异；6例显示p53变异仅发生于肝转移组织;另有3例原发灶有p53变异的病人在转移灶除保留原有变异外，还出现了新增加的变异。在原发、转移灶共47处p53变异中，以Codon196,248,273最为多见(图1)。点突变主要表现为G∶C→A∶T,氨基酸的改变主要为精氨酸和谷氨酸。
图1 41例大肠癌肝转移患者原发灶和肝转移灶
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p53突变在各codon的发生频率
图2肝转移灶含变异及野生型p53患者的生存期分析
2.2生存分析
根据肝转移灶中p53DNA测序结果将病人分为野生型p53组和突变型p53组，分别统计两组病人肝部分切除术后的生存期，以Kaplan-MeierSurvivalAnalysis程序分析(图2)。p53突变组的中位生存期是80个月，而野生型P53组仅为18个月；Log-rankTest发现两组病人生存期有显著性差异(P=0.0068)。在p53突变组未发现任何特异的变异与生存期有规律性的联系，但p53无义突变病例的生存期明显短于p53突变组中的其他病例。
3讨论
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结直肠癌特别是在有继发肝转移时，p53基因突变率高达50%～80%[2，7]，本组患者突变率为63%，与报道相符。P53突变热点分别在exon8的248和273密码子以及exon6的196密码子，亦与文献报道相符[6,8]。点突变主要表现为G∶C→A∶T,改变后的氨基酸主要为精氨酸和谷氨酸。
本实验基因分析证明，18例在原发灶显示的p53变异，在其相应的转移灶均被证实；另有6例在大肠原发灶未证实到变异p53的病人，在肝转移灶出现了p53变异；3例在原发灶已有p53变异的病人，在转移灶除观察到同样的变异外，还发现了新的变异。由此证明，p53变异主要开始于原发大肠癌灶，并保持于转移到肝脏的大肠癌细胞内，在转移过程中变异了的p53特性不变，只有极少数其变异位点增多。p53突变偶尔也可以始发于转移癌灶。
关于p53突变和患者生存期的关系，相关的文献一直比较多，有作者报道p53突变的结直肠患者生存期明显缩短[2，8]，也有人认为两者间设有相关的关系[9]，但均是直接比较结直肠癌病人的p53status和生存期，从未有作者对结直肠癌肝转移病人的p53status和术后生存期的关系进行研究。本实验表明，在肝转移灶有p53变异的病人，肝切除术后，存活时间长于癌灶内没有p53变异病人，而后者的死亡原因主要为癌复发。如果p53由于细胞周期调控而在抑制肿瘤生长中起到一个关键作用，从基因学的角度，按照逻辑思维，应该有理由观察到如期望那样的p53突变和生存期的负相关关系。而我们的结果却提示在肝手术后这样特定条件下，机体并不遵循上述规律。
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我们推测这是因为在肝部分切除之后，机体内由Kupffer细胞、肝细胞及其他细胞合成、分泌的生长因子应激性地显著增加(包括EGF、HGF、IGF-I、II、TGF-α、β等)[10]，它们不仅刺激正常肝组织细胞的再生，也作用于残留在肝内的癌细胞。因此，基于治疗意义的外科手术过程，对于那些术中未被发觉而残留于肝内的微小癌细胞灶，在客观上创造了一个加速生长的生物学环境。在同样一个生物学环境下为什么有正常p53基因(野生型p53)的癌细胞远比p53基因突变的癌细胞增生快、出现临床复发早？我们推测这两类细胞代表生物学上不同的细胞群。p53突变基因的积累(我们前期工作证明，p53变异的DNA量或含变异p53的癌细胞量在转移灶明显高于原发灶[11])可能使其肿瘤细胞在生物功能上损害更多，导致含突变型p53的癌细胞比含野生型p53的癌细胞对生长刺激的敏感性降低，因而对于术后大量释放出的生长因子的反应低于后者，使含突变p53的残余癌细胞在术后增生繁殖速度远低于野生型p53的癌细胞。这也就决定了后者的术后复发早于前者、术后生存期短于前者。应指出，这两组病人生存期的差异并不意味着p53基因突变改善了患者术后生存期，很可能是p53无突变使肿瘤患者的术后生存期缩短了。以上假说有待进一步的实验来验证。
, http://www.100md.com
致谢：本研究得到瑞典哥德堡大学医学部外科peterNaredi,Kentlundholm教授的指导和支持，在此致谢!
基金项目：全军医药卫生科研基金(98H013),国家自然科学基金(39970721)及广东省自然科学基金(990411)
[参考文献]
[1] Marx J. how Cells Cycle toward cancer [J]. Science,1994, 263： 319～ 319.
[2] Saigusa N, Maruyama K, Sugimura H, et al. The results of p53 immunostaining in colorectal adenomas, early cancers, advanced cancers and their hepatic metastasis [J]. Gan To Kagaku Ryoho, 1996, Suppl 2： 159～ 163.
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[3] Cottu PH, Muzeau F, Estreicher A, et al. Inverse correlation between RER+ status and p53 mutation in colorectal cancer cell lines [J]. Oncogene, 1996, 13： 2727～ 2730.
[4] M kato, Iot Y, Kobayashi S, et al. Detection of DCC and Ki-ras gene alterations in colorectal carcinoma tissue as prognostic markers for liver metastatic recurrence [J]. Cancer, 1996, 77： 1729～ 1735.
[5] Kropveld A, Slootweg PJ, Mansfeld AD, et al. Radioresistance and p53 status of T2 laryngeal carcinoma： Analysis by immunohistochemistry and denaturing gradient gel electophoresis [J]. Cancer, 1996, 78： 991～ 997.
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[6] Pocard M, Chevillard S, Villaudy J, et al. Different p53 mutations produce distinct effects on the ability of colon carcinoma cells to become blocked at the G1/S boundary after irradiation [J]. Oncogene, 1996, 12： 875～ 882.
[7] Maruyama K, Tanaka T, Baba S, et al. p53 accumulation in colorectal cancer with hepatic metastasis [J]. Japanese J Cancer research, 1996,87(4)： 368～ 376.
[8] Diez M, Camunas J, Enriquez JM, et al. A Comparative study on the prognostic value of the nuclear expression of protein p53 vis-a-vis histopathology in colorectal cancer [J]. An-Med-Interna, 1996, 13： 222～ 226.
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[9] Miki T,Funahashi K,Tsujita K,et al. An immuno-histochemical study of the relation-ship between p53 expression and the DNA ploidy pattern using image cytometry in colorectal carcinoma [J]. Gan To Kagaku Ryoho, 1995, 22 Suppl 2： 130～ 133
[10] Brenner DA. Signal transduction during liver regeneration [J]. J Gastroenterol Hepatol， 1998,13(5)： 93～ 95
[11] 杨洋，夏琼，连方杰，等.大肠癌患者原发灶和肝转移p53变异及蛋白表达[J].中华肿瘤杂志,1999,21(2)：114～118.
收稿日期：1999-11-01；修回日期：1999-11-19, 百拇医药